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实验动物:BALB/c成年小鼠,体重18-22g。
实验分组及受试样品给予时间:实验室自制样品分别设三个剂量组(低剂量组、中剂量组、高剂量组),另外设一个正常对照组,实验小鼠除每天给予基础饲料和水外,每天灌胃受试样品一次(正常对照组灌胃生理盐水),受试样品给予时间为28天。
增强免疫力活性试验分组设计
样品 | 组别 | 灌胃浓度 |
正常对照组 | 生理盐水 | 生理盐水 |
海参肽 | 低剂量组 | 85mg/kg |
中剂量组 | 170mg/kg | |
高剂量组 | 340mg/kg | |
海参多糖 | 低剂量组 | 50mg/kg |
中剂量组 | 100mg/kg | |
高剂量组 | 200mg/kg |
1、脏器指数
小鼠在末次给药后,禁食不禁水12h,称体重,处死后取脾脏及肝脏器官并称重,分别计算脏器指数。
样品 | 体重(g) | 脾脏指数(mg/g) | 肝脏指数(mg/g) |
正常对照组 | 22.45±1.96 | 3.88±0.52 | 35.01±2.04 |
海参肽低剂量组 | 22.33±1.71 | 4.48±0.11 | 44.43±3.77 |
海参肽中剂量组 | 21.72±0.65 | 3.95±0.52 | 40.74±1.28 |
海参肽高剂量组 | 22.15±0.90 | 4.22±1.15 | 49.04±3.70 |
海参多糖低剂量组 | 21.36±1.12 | 3.94±0.59 | 42.79±0.34 |
海参多糖中剂量组 | 22.94±1.38 | 4.96±1.07 | 42.79±1.83 |
海参多糖高剂量组 | 21.27±1.23 | 4.39±0.73 | 45.71±4.54 |
备注:*表示显著性差异(P<0.05)
**表示极显著性差异(P<0.01)
结果显示:各组之间在体重及脏器指数方面无显著性差异。
2、细胞免疫(MTT)
Con A 诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验
仪器和材料:RPMI1640细胞培养基、小牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐酸、异丙醇、MTT、Hank’s液、PBS缓冲液(PH7.2-7.4)
纱布或200目筛网、24孔培养板、96孔培养板(平底),手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721分光光度计、超净工作台、高压灭菌锅、无菌滤器。
操作规程:无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank’s 液的小平皿中,制成细胞悬液, 经200目筛网过滤。用 Hank’s液洗2次,每次离心10 min(1000r/min)。将细胞悬浮于1 mL完全培养液中,计数活细胞数,用 RPMI1640培养液调整其细胞浓度至3×106个/mL。再将细胞悬液分两孔加入 24 孔培养板中,每孔 1 mL,在其中一孔加入75 µL ConA液(相当于7.5µg/mL),另一孔不加作为对照,培养板置于5% CO2、37℃培养 72 h。培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液0.7mL,加入不含小牛血清的RPMI 1640培养液,同时加入MTT(5mg/mL)50µL/孔,继续培养4 h。培养结束后,每孔加入1mL酸性异丙醇,吹打均匀,使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中,每个孔作3个平行孔,使用酶标仪以570 nm 波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力=ODCon A-OD 无
样品 | 淋巴细胞增殖能力 |
正常对照组 | 0.0122±0.0087 |
海参肽低剂量组 | 0.0126±0.0121 |
海参肽中剂量组 | 0.0177±0.0140 |
海参肽高剂量组 | 0.051±0.0367** |
海参多糖低剂量组 | 0.0167±0.0031 |
海参多糖中剂量组 | 0.0228±0.0237 |
海参多糖高剂量组 | 0.0326±0.0195* |
备注:*表示显著性差异(P<0.05)
**表示极显著性差异(P<0.01)
从试验结果中可以看出,与对照组相比,海参肽的高剂量组以及海参多糖的高剂量组在淋巴细胞增殖能力方面具有显著性差异,因此可以判定,此项结果中海参肽和海参多糖在细胞免疫方面均有较好的增强免疫力效果。
3、血清溶血性测定
用SRBC免疫动物后,产生抗SRBC抗体(溶血素),利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。
每只鼠腹腔注射0.2mL 2%的SRBC进行免疫,4-5天后,摘除眼球取血于离心管内,放置约1h,将凝固血与管壁剥离,使血清充分析出,2000r/min离心10min,收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释,将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内,每孔100µL,再加入100µL 0.5%的SRBC悬液,混匀,装入湿润的平盘内加盖,于37℃温箱孵育3h,观察血球凝集程度。计算抗体积数,受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平,可判定该项实验结果阳性。
样品 | 抗体积数 |
正常对照组 | 74.67±4.38 |
海参肽低剂量组 | 76.00±4.61 |
海参肽中剂量组 | 76.67±4.13 |
海参肽高剂量组 | 87.10±4.38* |
海参多糖低剂量组 | 79.67±4.61 |
海参多糖中剂量组 | 87.67±4.38* |
海参多糖高剂量组 | 96.00±4.61* |
备注:*表示显著性差异(P<0.05)
**表示极显著性差异(P<0.01)
从结果来看,海参肽的高剂量组、海参多糖的中、高剂量组与对照组相比,抗体积数水平显著增大,因此此项结果可以判定海参肽及海参多糖在体液免疫方面有一定的作用。
结论:在增强免疫力方面,海参肽及海参多糖的高剂量组对增强免疫力也有一定效果。